- 本文來自《领研网》。撰文／戚譯引。
中國科學家發表兩篇 Science 論文，對多種基因編輯工具進行「測評」。兩項研究都指出，被學界看好的單鹼基編輯工具有著極高的脫靶風險，其中一項還提出了全新的脫靶率檢測技術「 GOTI 」。
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CRISPR 基因編輯技術已經發展出多種形式，然而它們都隱含著同樣的風險，那就是脫靶（off-target）——意外編輯了基因組中其他的基因，造成不可預測的後果。在去年底引發巨大爭議的賀建奎事件中，許多科學家就表達了同樣的擔憂：這次編輯究竟有沒有發生脫靶？你怎麼證明沒有脫靶？
學術界早就意識到脫靶問題的存在，但量化評估十分困難。3月1日，中國科學家為主的兩個團隊在 Science發表論文，每篇論文只有兩頁，卻揭示了同一個重要的資訊：
基因編輯有風險，其中單鹼基編輯系統（base editor）脫靶尤其嚴重。
什麼是單鹼基編輯？
單鹼基編輯技術由 CRISPR-Cas9 改進而來。CRISPR 技術的基本原理，就是用 RNA 引導 Cas9 等核酸內切酶對 DNA 上的目的地區域進行編輯，可以刪除或啟動目標基因。核酸內切酶有許多種，Cas9 是其中最早被發現、應用最廣泛的，此後被發現的酶還有 Cpf1、Cas12b、Cas13 等。
Cas9 同時對 DNA 的雙鏈進行剪切，形成雙鏈斷裂（double strand breaks，DSBs），修復的過程中容易產生新的突變。而單鹼基編輯器對 Cas9 進行了改進，並添加了脫氨酶（deaminase），只對 DNA 的一條鏈進行切割，然後精確地對一個鹼基進行修改。
去氧核醣核酸（DNA）的雙股螺旋結構。在該結構中的原子是按元素進行顏色編碼，還有兩個鹼基對的詳細結構示於右下角。圖／wikimedia
根據目標鹼基的不同，單鹼基編輯工具可分成兩類，一類是胞嘧啶單鹼基編輯器（cytidine base editor，CBE），將胞嘧啶（C）轉換成胸腺嘧啶（T）；另一類是腺嘌呤鹼基編輯器（adenine baseeditor，ABE），將腺嘌呤（A）轉換成鳥嘌呤（G）。
單鹼基編輯看起來操作更精確，因而被寄予厚望。但這次的兩篇 Science 論文對不同編輯技術的脫靶率進行了評估，發現胞嘧啶單鹼基編輯器具有極高的風險。
全基因組範圍的脫靶效應：自然突變的兩倍
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中國科學院遺傳與發育生物學研究所高彩霞團隊用水稻進行實驗，發現 CBE 會引發全基因組範圍的脫靶效應，其引發的突變數量大約是自然環境下發生突變的兩倍（DOI: 10.1126/science.aaw7166）。
高彩霞團隊借助全基因組測序技術，對三種應用廣泛的單鹼基編輯工具 BE3、高保真 BE1（HF1-BE3）和 ABE 進行了檢驗。與野生型對照組和 ABE 相比，BE3 和 HF1-BE3（均屬於 CBE）引發了數量顯著更多的單核苷酸變異（single nucleotide variant，SNV），主要是將基因組中其他部位的胞嘧啶也變成了胸腺嘧啶。
研究還發現，脫靶預測演算法 Cas-OFFinder 預測並不準確。在接受 BE3 編輯的植株中，只有 6 處突變發生在預測的 3 個突變部位中；而在接受 HF1-BE3 和 ABE 編輯的植株中，沒有一處突變發生在預測的部位中。
GOTI：評估脫靶的新方法
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中國科學院神經科學研究所楊輝團隊和史丹佛大學 Lars M. Steinmetz 團隊合作的研究，也得出了相似的結論：Cas9 和 ABE 引發的單核苷酸變異較少，而 CBE 讓突變的數量翻了 20 倍（DOI: 10.1126/science.aav9973）。
該研究的另一亮點在於提出了全新的脫靶評估技術 GOTI（Genome-wide Off-target analysis byTwo-cell embryo Injection）：在小鼠胚胎卵裂球的二細胞期，對其中一個細胞進行基因編輯，並進行螢光蛋白 tdTomato 標記；隨後，在胚胎發育的第 14.5 天用流式細胞儀（FACS）將兩個細胞的子代進行分離，分別進行測序。
借助 GOTI 技術，科學家第一次能夠對脫靶進行全面的量化評估。楊輝團隊對 CRISPR-Cas9、BE3 和 ABE7.10 進行了檢驗，全部 12 組中發生的插入／缺失（indel）數量在 0 到 4 之間，並且沒有一個發生在預測的脫靶部位。
實驗發現，在經過 BE3 編輯的胚胎中平均發生 283 個 SNV；相比之下，經過 ABE7.0 編輯的胚胎平均發生 10 個 SNV，與自然突變的數量無顯著差異。而且， BE3 編輯引發的一些突變發生在原癌基因或抑癌基因上，這進一步提示了可能的致癌風險。
臨床應用要謹慎
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Science 採訪了業內人士對此的看法。
- 哈佛大學化學家、第一代鹼基編輯器的發明者劉如謙（David Liu）認為：基因編輯的錯誤整體上仍屬罕見，不太可能對實驗室應用造成影響，但足以為那些想要在病人身上進行試驗的人敲響警鐘。
- Cas-OFFinder 的發明者、來自韓國國立首爾大學（Seoul National University）的 Jin-Soo Kim 說：「這兩篇論文很有趣，也很重要。現在重要的是找出是哪一種成分引發了其他突變，以及如何減少或消除它。」
- 麻省總醫院（Massachusetts General Hospital）病理學家、劉如謙的合作夥伴 J. Keith Joung 認為：對編輯器中的脫氨酶或其他成分進行改進或許能夠減少脫靶效應。
基因編輯療法被寄予厚望。在治療鐮刀形紅血球貧血症、萊伯氏先天性黑蒙症方面，相關治療手段已進入臨床試驗階段。而這兩項研究進一步提示了基因編輯技術可能存在的風險，再次說明了在投入臨床應用前進行充分安全性評估的必要性。
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